C18H16BrN5S

414.32

298-93-1

MTT主要有两个用途：

1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；

2．细胞增殖及细胞活性测定。

MTT原理：

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Zā）（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚碸（DMSO）能溶解细胞中的甲臜（Zā），用酶标仪在490nm波长处（英文说明书写的是570nm）测定其光吸收值，在一定细胞数範围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有10⁵个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成数量与细胞数呈的线性关係。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的範围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间範围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什幺时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4. 培养时间。200ul的培养液对于10的4-5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，儘量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。

7. 实验时应设定调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚碸。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚碸，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8. 避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，儘量吸净培养孔内残余培养液。

mtt

通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配製和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7範围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配製成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反覆冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那幺多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套，配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关係，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。

配製MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

PBS配方：

Nacl 8g

Kcl 0.2g

Na2HPO4 1.44g

KH2PO4 0.24g

调pH 7.4

定容1L

1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔，建议设5个，否则难以反应真实情况。

3. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。

6. 每孔加入150ul二甲基亚碸，置摇床上低速振荡0.5min，使结晶物臜（Zā）充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 560nm处测量各孔的吸光值。

7. 同时设定调零孔（培养基、MTT、二甲基亚碸），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚碸）。

mtt

1. 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×10⁶/ml，按次序将：①补足的1640（无血清）培养基40ul；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释（储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×10⁴cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）。

2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3. 每孔加入10ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后可跳过步骤4，直接酶联免疫检测仪OD 560nm（630nm校準）测量各孔的吸光值）。

4.离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚碸，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 560nm（630nm校準）测量各孔的吸光值。

细胞过了30代以后就不要用了，因为状态不好了；培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重複利用的板只可做预实验。

接种时最好按照预实验摸索出的密度接种，因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关係最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关係不佳。故而MTT细胞密度多採用10000/ml，100ul/孔。

细胞密度要根据不同细胞的特点来定。如果你做的药品对细胞具有刺激作用那幺取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那幺取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到10⁵，贴壁细胞可为10³-10⁴。

其它的声音

1. 首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。（对于不同的细胞，每孔细胞数要摸索一下，对照组OD在1.4以下为佳，当然通常来说更不要超过2。）

2. MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20%的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。

3. 我做的是肿瘤细胞的MTT实验，这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的，结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关係。后来调整浓度，用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验，结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的。用40000/M的浓度的组，由于细胞少，药物作用的梯度还是有，只是没有很好的线性关係。还有根据细胞生长速度以及药物的特性（有时间依赖性和浓度依赖性的药物）来确定培养时间是48小时还是72小时。

注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉澱下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，儘量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练些、快些上板。